真的搞错了吗？RNA去甲基化酶FTO的作用底物解读丨特别推荐

BioArt按：最近一段时间，围绕m6A修饰的相关研究有种让人应接不暇的感觉，而且对于催化、去除和识别m6A的酶或者蛋白基本上学术界已经有一个统一的定论了。然而前不久，康奈尔大学医学院的Samie R. Jaffrey课题组在Nature上发表一篇长文，文章赋予了m6A甲基化修饰酶FTO新的重要催化功能，并且暗示FTO事实上更多的酶活是催化m6Am而不是m6A去甲基化。当然，如果Samie课题组的这一结论是对的话，那么过去围绕FTO酶活的研究就会受到严重的质疑，然是事情究竟是怎样呢？为此，BioArt特别刊登了北京大学化学与分子工程学院的博士生段洪超关于上述问题的详细解读，将有助于读者朋友更深入地了解科学研究的真谛所在。

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撰文 | 段洪超（北京大学化学与分子工程学院博士生）

m6A，还有它背后的RNA表观遗传学/表观转录组学，已经是一座名副其实的金矿了。淘金越来越火热，大佬们各说各话，各种研究结果也是铺天盖地的。声音的来源多当然是好事啦，说明这是个方兴未艾的“活”领域，对于在这个大坑里扑腾的小弱，最好的消息肯定是发的文章引用次数必然“咔咔”地涨，也就不用愁没有杂志接收了。不过，如此庞杂的研究结果，其中甚至还有相矛盾的结论，怎样摸清脉络、把握方向、去伪存真，还真得多下些工夫。笔者说来也在这个领域做过蛮长时间了，这里就和大家讲一些其中的小trick。

就拿FTO在体内的作用底物这件事来说吧。今年年初，康奈尔大学的Samie Jaffrey教授搞了个大新闻，他在一篇Nature文章上报道称，mRNA上5’cap区域的m6Am修饰是可逆的，并且调控了mRNA的稳定性和翻译效率【1】。和m6A一样，m6Am也是在上个世纪70年代就被发现的mRNA修饰，然而这么多年来，它的功能一直是个谜，甚至连它是怎么来的（甲基转移酶）都不知道。本来嘛，发现了一个新的RNA修饰的功能，小弱们只要在后面紧跟一波就行了，没成想定睛一看，竟发现m6Am修饰的去甲基酶是FTO，而且FTO对m6Am的酶活还比m6A要强很多，作者还在文章中暗示，m6Am才是FTO在体内真正的底物。

笔者当时被hè了一跳，RNA表观遗传学的开山之作被人推翻了？话说FTO是最早通过全基因组关联分析找到的肥胖相关基因，自发现伊始就被各方关注（这可都是NIH的小钱钱啊），可是它到底是干嘛使的却在很长一段时间内不为人所知。2011年，何川教授实验室最先确定了FTO的作用底物是mRNA上的m6A，而这也是第一个被发现的可逆RNA修饰【2】，RNA表观遗传学/表观转录组学的研究由此肇始。贾桂芳博士和付晔博士的这篇Nature Chemical Biology也真不是盖的，6年560次引用。随后在2013年，他们二人进一步探究了FTO对m6A作用的详细机理【3】，FTO将m6A依次氧化为hm6A、f6A，这两个中间产物不稳定，分别脱除一分子甲醛和甲酸转变为正常的A，FTO对m6A的去甲基作用算是坐实了。现在突然有人告诉笔者，FTO的作用底物不是m6A？赶紧让我喝一口82年的蒸馏水压压惊。

图1 m6A和m6Am

m6A和m6Am的差别仅在于核糖2’-O上的甲基修饰（图1），从化学的角度看，其实它们是很相似的。而FTO所作用的都是N-6位的甲基修饰，想来它也不会太过“厚此薄彼”。在大坑里扑腾久了，有件事必须了然于胸，越是劲爆的文章，就越要留心它的实验是怎么做的，数据是怎么处理的，这些数据到底能不能支持它的结论。所以笔者把Samie Jaffrey教授的这篇文章连同扩展数据、支撑材料都仔细扣了一遍，果然发现了一些不大对劲的地方。

Samie文章里称得上实锤的证据大抵上有这么两点，首先最直接的，FTO的敲除和过表达没有显著影响细胞内m6A修饰的水平（图3）。这个和何川教授2011年的Nature Chemical Biology文章相矛盾。不过笔者发现，这两篇文章中m6A修饰水平的检测方法是不同的，而对相关实验不熟悉的小伙伴，发现这一点似乎还真不容易。

简单来说，Samie的检测方法比较糙一些。RNase T1是一种特异性在碱基G后面切割的RNA酶，利用很多m6A分布在G后面的特点，用RNase T1对待检测样品进行消化，并在新暴露出的5’末端加上放射性的32P——这样一来，包括m6A在内的相当一部分碱基就被标记了，再将RNA消化为单个的核苷酸，并用二维薄层色谱展开，比照各种核苷酸标准品的展开位置（图2），就可以计算出某种核苷酸的相对含量了。

图2 用二维薄层色谱法检测各种核苷酸的含量

细心的小伙伴可能已经发现，这种方法只能检测到RNA上位于G后面碱基中m6A的含量。而事实上，m6A在mRNA上通常出现在RRACH（R表示G或A，H表示A、C、U）的序列模式中，也就是说，m6A不仅位于G的后面，还位于A的后面，但是Samie的方法却将这部分m6A完全忽略掉了。

图3 在Samie Jaffrey教授的文章中，过表达和敲低FTO对碱基G后的m6A含量没有影响

另一方面，何川教授的文章使用了液相色谱-三重四极杆质谱联用的方法。这种方法就很直接啦，将待检测的RNA样品用酶消化成单个的核苷，经由LC-MS/MS检测，并比照标准样品计算出每种核苷的绝对含量。由此，mRNA上所有m6A都可以被检测到，结果也就更靠谱了。

Samie文章另一个证据呢是FTO对m6Am的酶活比m6A要强100倍（kcat/Km）。不过，笔者文献看得多，一般人骗不了的。之前多项独立工作【2,4,5】均报道FTO对m6A的kcat/Km在0.6~0.7 min^-1μM^-1的范围内，而Samie Jaffrey教授这篇文章中所测得的数值只有0.06，直接低了10倍，确定这不是在开玩笑？笔者都不禁要怀疑某些同学的实验能力了，这样的酶纯化、生化反应水平真的过关么？

那这样看来，从实验数据的角度，Samie Jaffrey教授的这篇文章确实是有不少问题的，并不能说是推翻了2011年何川教授的文章。不过，这些也只是从已发表数据中发现的一些，如果可以看到相关实验的第一手数据，事情的脉络可能会变得更清晰。虽然不从事FTO的研究，笔者还是联系的2011年Nature Chemical Biology文章的第一作者，现在在北京大学化学与分子工程学院任职的贾桂芳博士，并拿到了一些相关的数据。

原来，本着科学严谨的态度，早在Samie Jaffrey教授的文章发表之初，贾桂芳博士实验室就在准备相关的实验，以厘清科学问题的真相。在对Hela细胞和HEK293T细胞敲低FTO之后，用液相色谱-三重四极杆质谱联用的方法分别检测m6A和m6Am的变化。结果表明，m6A和m6Am的修饰水平都出现了显著的升高，以HEK293T细胞为例，敲低FTO，m6A/A升高7.9%，而m6Am/A升高29.7%，但是由于m6Am的含量仅为m6A的十分之一，这样算下来，FTO作用于m6A的绝对个数是m6Am的2.7倍！

图4 用LC-MS/MS检测，FTO在体内既影响了m6A修饰，又影响了m6Am修饰

而后，他们采用了与Samie Jaffrey教授相同的实验条件，相同量的FTO蛋白用量对相同量的从Hela细胞中提取的mRNA进行了体外去甲基反应，结果看到有75%的m6A去甲基化率，小编好奇如此大的变化，Samie大教授的实验结果怎么能显示去甲基率为零呢！接着贾桂芳博士实验室进一步降低FTO蛋白用量，在m6Am不被完全去甲基的条件下，可以相对比较FTO对m6A和m6Am的去甲基化效率。虽然表面看FTO对m6A的去甲基率要低于m6Am，但必须注意到一个问题，因为m6A在mRNA上的含量是m6Am的10倍，这样计算下来，被FTO去甲基的m6A的绝对量还是要显著地多于m6Am。

图5 FTO对mRNA上m6A和m6Am的体外酶活实验

而如果用同样的标准去考量体内实验的数据，他们发现，在每1000个碱基A中，FTO的knock down所影响的m6A数量约为0.2~0.3个，与体外实验结果相近，而影响的m6Am的数量却是0.07~0.11个，明显要低于体外实验（参见图4）。有一种可能的解释，体内的m6Am集中在5’cap区域，而mRNA的5’cap却被结合蛋白所包围，它们会阻碍FTO接近m6Am。这样一来，FTO在体内对m6Am的作用也就大大受限了。

意外地，笔者还了解到，其实早在几年前，何川教授实验室的付晔博士就已经发现了FTO对m6Am的去甲基活性，相关内容还可以在付晔博士的毕业论文中查阅到【6】——他正是基于m6A和m6Am的结构相似性预测了FTO同样可以作用于m6Am，并通过实验进行了验证（图6）。同时，付晔博士也指出，尽管人们还不知道m6Am的甲基转移酶，但是早年的研究显示，将Am转变为m6Am的酶活性主要是在细胞质当中，而FTO却主要定位在细胞核里，从这个角度考虑，FTO在体内对m6Am的影响究竟有多大，或许还要留一个悬念了。

图6 付晔博士thesis里（2012年）已报道FTO对m6Am的反应活性

那如果要给Samie Jaffrey教授这篇文章一个中肯的评价，就是发现了一种RNA修饰的生物功能（其实实验本身还是沿用了何川教授实验室之前文章的套路），能否称为某种开山立派的新发现，还是要看随后的follow-up啦。FTO作为一个m6A去甲基酶，已经被证明在白血病【7】、DNA损伤修复【8】以及热胁迫应激【9】中起到了关键的作用，而它对m6Am的去甲基作用是否会广泛地调节生命活动，还有待时间的检验。我猜至少这是Nature出版集团乐见的。事实上，RNA表观遗传学算是为数不多的由华人主导的生物学研究前沿领域了，或许Nature Press想听到一些不一样的声音，而Samie正是他们希望的那种。这些声音要如何来听，小伙伴们也要加小心了。

参考文献

[1] Mauer, J. et al. Reversible methylation of m6Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature 541, 371-375, (2017).

[2] Jia, G. et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity associated FTO. Nat Chem Biol 7, 885-887, (2011).

[3] Fu, Y. et al. FTO-mediated formation of N6-hydroxymethyladenosine and N6-formyladenosine in mammalian RNA. Nat Commun 4, 1798 (2013).

[4] Zhu, C. & Yi, C. Switching Demethylation Activities between AlkB Family RNA/DNA Demethylases through Exchange of Active-Site Residues. Angew Chem 53, 3659-3662 (2014).

[5] Zou, S. et al. N6-Methyladenosine: a conformational marker that regulates the substrate 192 specificity of human demethylases FTO and ALKBH5. Scientific reports 6, 25677, (2016).

[6] Fu, Y. Dynamic regulation of rna modifications by AlkB family dioxygenases. Ph.D. thesis, The University of Chicago, (2012).

[7] Li, Z. et al. FTO Plays an Oncogenic Role in Acute Myeloid Leukemia as a N6-Methyladenosine RNA Demethylase. Cancer Cell 31, 127–141 (2017).

[8] Xiang, Y. et al. RNA m6A methylation regulates the ultraviolet-induced DNA damage response. Nature 543, 573–576 (2017).

[9] Zhou, J. et al. Dynamic m6A mRNA methylation directs translational control of heat shock response. Nature 526, 591–594 (2015). 

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